Biserica Bărboi este zidită din blocuri de piatră de talie alternând cu șiruri de cărămidă. Ea are planul în cruce greacă, după stilul bisericilor athonite, au mici abside semicirculare, mai scunde decât înălțimea zidurilor, flancate de pilaștri prismatici sprijiniți pe soclu. Lăcașul de cult este luminat prin ferestre cu chenare simple, terminate la partea superioară în semicerc.
Deasupra bisericii se află o turlă centrală sprijinită pe o bază pătrată, flancată de patru turle mici sprijinite pe baze octogonale. Turla centrală are opt ferestre încheiate în semicerc, iar turlele laterale au câte patru ferestre, intercalate de câte patru ocnițe oarbe. Turlele laterale încadrează absidele laterale ale edificiului.
Intrarea în biserică se face printr-un pridvor deschis de pe latura de vest sau printr-o ușă aflată pe latura sudică, în dreptul altarului, la care se ajunge urcând pe șapte trepte din piatră. În pridvor se intră prin urcarea a cinci trepte largi, semicirculare. Pridvorul are cinci arcade (trei pe latura de vest și câte una pe laturile de nord și de sud) sprijinite pe patru coloane cu capiteluri dorice, arcada centrală fiind mai largă și mai înaltă decât celelalte patru. Deasupra pridvorului se află o încăpere dreptunghiulară luminată prin cinci ferestre (trei pe latura de vest și câte una pe laturile de nord și de sud), având deasupra un fronton triunghiular cu o cruce în vârf.
Interiorul este împărțit în trei nave (una centrală și două laterale) prin două rânduri de câte patru coloane. Primele și ultimele sunt din piatră marmurată cu capiteluri dorice, iar celelalte patru din marmură cu capiteluri ionice. În pereții de nord și de sud ai bisericii se află pilaștri prismatici sprijiniți pe soclu, care creează cu coloanele din biserică o rețea de bolți în cruce.
Pictura interioară a bisericii a fost realizată în prima jumătate a secolului al XIX-lea. Inscripțiile de pe icoane sunt în limba greacă. Pictura este influențată de stilul renascentist, majoritatea figurilor fiind expresive, iar culorile îmbinate armonios. În cupola naosului este reprezentat Iisus Pantocrator, iar în pandantivii de la baza cupolei cei patru evangheliști. În cupola altarului este pictată Maica Domnului cu Pruncul, înconjurată de soborul sfinților și îngerilor. La fel de veche este și catapeteasma din lemn sculptat și poleit cu aur.
Mitropolitul Grigore de Irinupoleos, ctitorul de la 1840
Grigore Irinupoleos, ctitorul actualei bisericii, de la 1840, s-a născut în 1764 în Efes În anii 1841-1844 el a fost proestos al mănăstirilor Golia și Bărboi, sau „efor al mănăstirilor vatopedine”, administrator al averilor din Moldova ale acestora. Contribuția sa la reconstruirea bisericii Bărboi (1840-1844) este menționată în pisaniile păstrate. Cel mai probbail, planul arhitectonic athonit al bisericii se datorează acestuia. Un portret al mitropolitului Grigore se păstrează pe peretele de vest al pronaosului Bisericii Bărboi
