Biserica veche a mănăstirii Bărboi (1615) dacă a avut o pictură interioară, înainte de 1670, aceasta trebuie să fi urmat iconogrofia locală, a
unei simple biserici de mir. După ce acest lăcaș a fost închinat la Vatoped, este posibil ca pictura interioară să fi fost adaptată, fie și parțial, la noua situație, potrivit dorinței călugărilor greci.
Edificarea noii biserici, la 1840, a necesitat o altă abordare a programului iconografic, din nouă motive: planul nou, neobișnuit, al bisericii și statutul de mănăstire.
Pictura interioară reflectă într-o manieră mult mai directă modelul athonit, ceea ce face ca acest lăcaș să poată fi numit „Vatopedul de la Iași”, fiind păstrată pe balustrada cafasului o frumoasă reprezentare a Mănăstirii Vatoped de la Muntele Athos. Modelul acestei imagini poate fi și astăzi identificat.
Prezentarea sumară a picturii murale din interiorul bisericii evidențează semnificația deosebită a programului iconografic, care are un mare grad de originalitate pentru Moldova. Practic, mitropolitul Grigore Irinupoleos, ctitorul de la 1840, a adus la Iași întreaga panoplie de sfinți athoniți a căror vieți exemplare reprezentau modele de urmat pentru monahii din obștea de la Bărboi. Mai multe din temele religioase reprezentate în pictura din biserica de la Iași își regăseau modelele directe în icoane aflate în mănăstirile de la Muntele Athos.
În ocnița funerară de pe peretele nordic al pronaosului este înfățișat Sf. Mihail în glorie (Biruitorul). Icoana zugrăvită poate fi o reverență către Mihai Sturdza, în domnia căruia a fost înălțată actuala biserică.
În rândul sfinților athoniți din pronaos, o prezență semnificativă este reprezentarea Sf. Grigore Palamas, călugăr la Muntele Athos, devenit arhiepiscop de Tesalonic.
Dacă în domeniul arhitecturii a fost remarcată de multă vreme expresia athonită a bisericii Bărboi, nu a existat o analiză a picturii murale care să evidențieze exact aceeași realitate: importarea universului iconografic athonit în vechea capitală a Moldovei. Pictura întregește în mod fericit arhitectura bisericii, fiind un veșmânt croit în același stil și în aceeași epocă.